WB實驗又稱免疫印跡實驗，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。

　　

　　對于一直都在做蛋白研究的你，在樣品制備中的小細節(jié)你都了解嗎？這里為大家整理了蛋白樣品制備中大大小小的常見問題，一起來學(xué)習(xí)吧！

　　

　　1、所有WB實驗都用總蛋白就可以完成嗎？

　　

　　當(dāng)然不是，要根據(jù)WB的實驗?zāi)康膩泶_定提取哪類蛋白，如需驗證某些低豐度蛋白，或蛋白定位，或組分間表達量對比，則需要進行亞細胞結(jié)構(gòu)分離或組分分離。

　　

　　2、如需添加蛋白酶抑制劑該如何添加？

　　

　　內(nèi)源性蛋白酶存在于胞漿中，所以要在細胞裂解前加入抑制劑到達理想的抑制效果，提取時將抑制劑添加到裂解液中，工作濃度1X。例如100X蛋白酶抑制劑，1ml裂解液中添加10ul即可。

　　

　　3、蛋白樣品如何儲存？

　　

　　A蛋白樣品不建議久存，也不要反復(fù)凍融。下游做WB實驗，建議蛋白濃度測定后，加入loadingbuffer煮樣，煮后根據(jù)實驗需要分裝成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮樣即可。

　　

　　4、樣品上樣前怎么處理？

　　

　　蛋白濃度測定后，建議將各個樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可以PBS，水或裂解液），加入loadingbuffer后，在沸水中煮3-5分鐘，使蛋白充分變性，也可使用PCR儀95度加熱5分鐘。

　　

　　5、組織樣品含血量多可以直接提蛋白嗎？

　　

　　如組織樣品中含血較多，血紅蛋白可能會影響WB實驗，可以在組織樣品裂解前使用紅細胞裂解液進行處理后，再進行蛋白提取。