文獻解讀|膽固醇通過改變蛋白冠的組成來調(diào)節(jié)對納米顆粒的生理反應

更新時間：2024-04-02

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文獻解讀

文獻背景

盡管納米粒子(NPs)在生物成像、藥物輸送、疫苗和癌癥免疫治療等方面具有潛在廣泛的應用前景，但由于其在臨床試驗中的表現(xiàn)效果不甚理想，已在市場上獲得批準的納米藥物數(shù)量仍低于預期。這種巨大差距的部分原因是缺乏對患者體內(nèi)的納米生物層面的了解。當納米藥物進入人體時，不可避免地會與體液中的生物分子相互作用，在其表面形成 “蛋白冠"(PC)。越來越多的證據(jù)表明，PC對納米藥物在體內(nèi)的生物分布、生物利用度和生物轉化具有重要影響。因此，了解PC的形成和生物學作用是納米藥物安全有效臨床應用的重要一步。

PC的形成可能受到許多因素的影響，例如生物體液中納米顆粒和蛋白質種類的理化性質。PC的蛋白質組學指紋圖譜為疾病的早期診斷、進展和預測提供線索。先前的研究表明，從不同供體獲得的人血漿樣本可以差異調(diào)節(jié)PC的成分，從而影響對NPs的生理反應。因此，個性化PC的概念（指在患者或健康個體中定制生成的PC）被提出，用于開發(fā)精密納米醫(yī)學。然而，決定PC形成和納米藥物隨后體內(nèi)行為的關鍵因素仍然知之甚少。代謝物，尤其是脂質，會吸附在NPs表面，但這種相互作用對PC形成的生物學意義尚不清楚。本文章探討代謝物如何驅動PC的形成并影響納米藥物的體內(nèi)命運，特別是在血清代謝物水平異常的相關疾病患者中。

基本信息

題目：Cholesterol modulates the physiological response to nanoparticles by changing the composition of protein corona

期刊：Nature Nanotechnology

IF：38.3

PMID: 37537273

DOI：10.1038/s41565-023-01455-7

通訊作者：徐承超，王繼剛

作者單位：中國中醫(yī)科學院中藥研究所

索萊寶合作產(chǎn)品：

貨號	名稱
BC1980	總膽固醇含量檢測試劑盒

摘要

生物體液中的納米顆粒(NP)形成一層稱為蛋白冠的生物分子。蛋白冠已被證明可以決定NP的生物學特性和體內(nèi)命運，但代謝物（尤其是與疾病相關的小分子）是否以及如何調(diào)節(jié)蛋白冠并隨后影響納米粒子在體內(nèi)的命運尚不清楚。此研究報告膽固醇對蛋白冠產(chǎn)生的影響以及隨后的影響。研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇水平（如高膽固醇血癥）會通過改變蛋白質與納米粒子的結合親和力，導致載脂蛋白富集和補體蛋白減少的蛋白冠。與正常蛋白冠相比，膽固醇介導的蛋白冠可以誘導巨噬細胞對納米顆粒產(chǎn)生更強的炎癥反應，并通過增強脂蛋白受體的識別來促進肝細胞對納米顆粒的細胞攝取。體內(nèi)生物分布測定結果表明，與健康小鼠相比，高膽固醇血癥小鼠的納米顆粒更容易被遞送至肝臟、脾臟和大腦，而不太可能被遞送至肺部。研究結果表明，代謝組譜是影響納米藥物的目標功效和安全性的未開發(fā)因素，這提供了一種通過利用與疾病相關的代謝物來開發(fā)個性化納米藥物的方法。

研究內(nèi)容及結果

1、膽固醇對蛋白冠形成的影響

作為一種必需的代謝物，膽固醇在膜組織和信號轉導中起著至關重要的作用。膽固醇代謝失調(diào)與多種人類疾病有關，例如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥。為研究膽固醇對NP上PC形成的影響，是否可能會導致納米藥物對高膽固醇血癥患者產(chǎn)生個體化效應。本研究選擇了兩種有前途的納米材料——二氧化硅納米粒子(SNP)和金納米粒子，它們在納米醫(yī)學中具有廣泛的應用。首先使用定義的系統(tǒng)測試了膽固醇在PC形成中的作用（圖1a）。將NP與補充膽固醇的胎牛血清(FBS)或正常FBS一起孵育，然后收集NP上形成的PC進行分析。電泳和蛋白質定量結果均表明，過量的膽固醇會以劑量依賴性方式降低PC含量（圖1b、c和擴展數(shù)據(jù)圖1a-d）。使用脂質體也進行了類似的觀察（補充圖1）。為了在更具臨床相關性的環(huán)境中證實該結果，收集了來自志愿者的三份具有不同膽固醇濃度(4.4mM、5.6mM和7.2mM)的人血清樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢（圖1d、e和擴展數(shù)據(jù)圖1e）。接下來，通過透射電子顯微鏡(TEM)直接觀察裸露的納米粒子和涂有來自正常FBS(Nor-PC)或含有高濃度(15.3mM)膽固醇的FBS(Cho-PC)的PC的納米粒子（圖1f）和冷凍TEM（擴展數(shù)據(jù)圖2a）。很明顯，膽固醇確實降低了納米顆粒的冠層厚度。對于AuNPs和SNPs的裸露的NPs、NPs-Nor-PC和NPs-Cho-PC的TEM尺寸和流體動力學直徑也支持了這一點（擴展數(shù)據(jù)圖2b-d）。

由于隨著膽固醇濃度的增加，更多的膽固醇被SNP吸收（擴展數(shù)據(jù)圖2e），接下來通過改變膽固醇蛋白或膽固醇-NP相互作用來研究膽固醇對PC形成的影響。為此，進行了競爭實驗（擴展數(shù)據(jù)圖3a）。一方面，用膽固醇對納米粒子進行預處理，明顯減少了納米粒子表面吸附的蛋白質數(shù)量；另一方面，高濃度膽固醇對PC形成的抑制作用通過用正常FBS中的蛋白質預先占據(jù)NP而部分逆轉（圖1g，h）。因此，膽固醇-蛋白質和膽固醇-納米顆粒相互作用都會影響納米生物界面中納米顆粒上蛋白質的吸附。綜上所述，血清中的膽固醇是個性化PC形成的關鍵因素。

圖1|剖析膽固醇介導的PC形成

圖2|膽固醇調(diào)節(jié)PC的

蛋白質組指紋圖譜

2、膽固醇調(diào)節(jié)蛋白冠的蛋白質組指紋圖譜

為了獲得有關在胎牛血清中的SNP上形成的Nor-PC和Cho-PC的蛋白質指紋圖譜的信息，進行了蛋白質組分析（擴展數(shù)據(jù)圖3b）。結果表明，血清中的高水平膽固醇可以豐富載脂蛋白并減少NP上PC中的補體蛋白。

圖3|Cho-PC引發(fā)巨噬細胞

對NP更強的免疫反應

PC的形成遵循“Vroman效應"，即早期吸附的高豐度蛋白質將被具有更高親和力的蛋白質競爭性取代。接下來通過微尺度熱泳(MST)測量了這兩種蛋白與有或沒有膽固醇的SNP的結合親和力（圖2e）。表明，膽固醇可以通過差異調(diào)節(jié)結合蛋白的親和力來重塑PC中的蛋白質豐度。然后，進行了分子動力學模擬，以探索在存在和不存在膽固醇的情況下APOE和SNP之間的相互作用。結果表明，膽固醇-蛋白質和膽固醇-NP相互作用有助于重塑Cho-PC組成的結論。

3、膽固醇-蛋白冠增加巨噬細胞對納米顆粒的免疫反應

由于PC已被廣泛認為是NP的生物學特性，于是探討了Cho-PC對NP體外和體內(nèi)行為的影響。由于游離膽固醇和膽固醇預處理的NP都不能增加免疫反應（圖3e，f），因此對NP的免疫反應增加主要受到PC中膽固醇介導的變化的影響。然后，進行蛋白質組分析，以鑒定與SNPs-Cho-PC和SNPs-Nor-PC孵育后巨噬細胞中差異表達的蛋白質。與對照組相比，SNPs-Nor-PC治療組中鑒定出788個下調(diào)蛋白和785個上調(diào)蛋白（擴展數(shù)據(jù)圖7c）。盡管Nor-PC和Cho-PC都激活了巨噬細胞的免疫反應，但Cho-PC引發(fā)了更強的反應。通過炎癥相關通路的基因集變異分析(GSVA)評分，發(fā)現(xiàn)了一致的變化（圖3i）。這些結果表明，Cho-PC可能比Nor-PC更大程度地增加免疫系統(tǒng)響應NP的激活風險。

4、Cho-PC增強肝細胞對NP的細胞攝取

由于細胞攝取對于納米藥物的藥代動力學和靶向效率至關重要，并且藥物通常由肝細胞代謝，進一步研究Cho-PC是否可能影響肝細胞中NP的細胞內(nèi)化。使用HepG2細胞作為人肝細胞的體外模型，首先評估了AuNP（擴展數(shù)據(jù)圖8a）和SNP（擴展數(shù)據(jù)圖8b）的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)HepG2細胞內(nèi)有更多的AuNPs-Cho-PC積累（圖4f，g）。電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)分析發(fā)現(xiàn)，Cho-PC組中檢測到的Au多于Nor-PC組（圖4h）。由于向培養(yǎng)基中添加膽固醇會抑制NP內(nèi)化（擴展數(shù)據(jù)圖8d-g），因此細胞對NP的攝取增強可能應歸因于膽固醇誘導的Cho-PC的特定蛋白質成分，而不是膽固醇本身。

為了進一步研究Cho-PC誘導的NPs增強細胞攝取所需的關鍵因素，檢測在不同類型的內(nèi)吞作用抑制劑存在下NPs的內(nèi)化（圖4i-k和擴展數(shù)據(jù)圖8h-m）。結果表明，膽固醇和肌動蛋白驅動的機制有助于增強對高膽固醇血清中形成的冠-納米顆粒復合物的攝取。由于攝取所需的細胞表面受體在PC介導的細胞攝取NPs中的既定作用，測試了低密度脂蛋白受體(LDLR)和B型清道夫受體1型(SR-B1)是否參與。在競爭測定中，細胞預先與LDL和HDL預孵育以阻斷LDLR和SR-B1，并使用牛血清白蛋白(BSA)孵育作為對照。盡管預孵育在一定程度上抑制了SNPs-Nor-PC和SNPs-Cho-PC的攝取，但只有LDL和HDL對SNPs-Cho-PC的攝取具有比對SNPs-Nor-PC更明顯的抑制作用（圖4l）。因此，LDLR和SR-B1可能參與脂蛋白介導的內(nèi)化增強。

圖4|Cho-PC增強了肝細胞中

NPs的細胞內(nèi)化

5、高膽固醇血癥小鼠體內(nèi)納米顆粒的生物分布

Cho-PC是否可以改變NP的體內(nèi)生物分布，通過高膽固醇飲食喂養(yǎng)小鼠15周建立高膽固醇血癥小鼠模型（圖5a）。詳細分析發(fā)現(xiàn)，與FBS和人血清中的結果相比，PC的蛋白質組成發(fā)生了類似的變化（圖5c、d和擴展數(shù)據(jù)圖9）。因此，血清膽固醇差異水平對PC制劑的調(diào)節(jié)也可以在小鼠高膽固醇血癥模型中重現(xiàn)，與人血清結果一致。接下來，比較了從正常小鼠和高膽固醇血癥小鼠收集的血液和組織中AuNP的體內(nèi)生物分布（擴展數(shù)據(jù)圖10a、b）。1小時后，在高膽固醇血癥小鼠中觀察到肝臟中鋅和銅水平增加。當24小時時，肝臟中的差異消失，但睪丸、腸、腎和脾中出現(xiàn)差異，這表明某些金屬元素的分布可能受到健康狀態(tài)依賴性靜脈注射納米藥物方式的影響。研究結果表明，當對健康和高膽固醇血癥個體進行靜脈注射時，基于納米粒子的納米藥物可能會出現(xiàn)不同的體內(nèi)命運，例如生物相容性和生物分布，這為精密納米醫(yī)學提供了重要的見解（圖6）。用熒光標記的衍生物測量了SNP的體內(nèi)分布，結果表明，高膽固醇血癥會影響納米粒子的體內(nèi)生物分布。

圖5|正常小鼠和高膽固醇血癥小鼠

中納米顆粒的體內(nèi)生物分布

圖6|NP在健康和高膽固醇血癥

個體中的命運

結論

本研究建立了一個FBS系統(tǒng)來研究膽固醇對PC形成的影響，研究發(fā)現(xiàn)高水平的膽固醇會增強載脂蛋白的保留，并減少PC中的補體蛋白。從小鼠和人類制備的高膽固醇血癥血清和正常血清驗證了結果。但值得注意的是，在血清這樣的復雜環(huán)境中，載脂蛋白和補體蛋白的動態(tài)變化也可能影響PC的形成。本研究揭示了Cho-PC對NP體外和體內(nèi)行為的影響。Cho-PC引發(fā)巨噬細胞對NP更強的免疫反應。使用HepG2細胞作為人肝細胞的體外模型研究了NP的細胞攝取，發(fā)現(xiàn)Cho-PC促進HepG2細胞中納米粒子的細胞攝取，詳細分析表明，增強的內(nèi)化是由細胞表面的SR-B1和LDLR以及細胞內(nèi)部的肌動蛋白驅動機制介導的。高膽固醇血癥中形成的Cho-PC確實改變了NP的體內(nèi)生物分布。對于金納米粒子等金屬納米粒子，它們可能與體內(nèi)的必需元素相互作用，導致體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)和不良生物效應。納米藥物的安全性應該以健康狀態(tài)依賴的方式進行評估，納米顆粒將在醫(yī)學領域得到廣泛的應用，形成的PC也可能受到周圍代謝環(huán)境的影響。

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