分光光度計(jì)的使用技巧

更新時(shí)間：2013-06-13

點(diǎn)擊次數(shù)：2017

分光光度計(jì)是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室*的好伙伴。它常用來(lái)測(cè)定生物樣品中的核酸、蛋白和細(xì)胞。這些樣品要么體積有限，要么濃度很高，為分光光度法測(cè)定帶來(lái)了一定挑戰(zhàn)。當(dāng)然，技術(shù)在不斷發(fā)展，讓微量樣品的測(cè)定成為現(xiàn)實(shí)。在分光光度計(jì)的使用過(guò)程中，有哪些需要注意的呢？讓專(zhuān)家來(lái)告訴你。

據(jù)介紹，分光光度計(jì)使用過(guò)程中的大問(wèn)題往往在于用戶(hù)選擇了錯(cuò)誤的方法或錯(cuò)誤的比色皿。而另一個(gè)問(wèn)題在于純化的策略不對(duì)。用戶(hù)應(yīng)正確選擇分光光度計(jì)，并注意下面的一些問(wèn)題。

低體積 vs. 低濃度

我們先要了解樣品的特性。有時(shí)，我們可能會(huì)混淆低體積和低濃度，產(chǎn)生有問(wèn)題的數(shù)據(jù)。這時(shí)，我們有必要回憶一下比爾-朗伯定律：當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí)，其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收介質(zhì)的厚度l成正比。根據(jù)這一定律，當(dāng)吸收介質(zhì)厚度不變時(shí)，A與c之間應(yīng)該成正比。而對(duì)于高濃度的樣品，應(yīng)使用較短的光程長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定。

樣品純度

樣品純度很重要，這不僅僅關(guān)乎分光光度法測(cè)定，也涉及到其他的下游應(yīng)用。樣品中的雜質(zhì)可能包括蛋白、緩沖液組分，甚細(xì)胞。你應(yīng)當(dāng)根據(jù)樣品量和濃度來(lái)選擇樣品制備策略。各大廠家都提供選擇指南和操作手冊(cè)，教你如何選擇適合的產(chǎn)品。此外，要避免過(guò)濾柱的過(guò)載，以免產(chǎn)生不純的樣品洗脫液。

選擇適當(dāng)?shù)谋壬?/span>

比色皿是光學(xué)透明的容器，裝有分析溶液，將樣品引入光路中。分析波長(zhǎng)在350 nm以上時(shí)，可選用玻璃或石英比色皿，在350 nm以下時(shí)須使用石英比色皿，當(dāng)然，現(xiàn)在也有一次性的塑料比色皿。有些比色皿提供不同的光程長(zhǎng)度，如Eppendorf的UVettes。它提供兩種不同的透光光徑：10 mm和2 mm。通常濃度的樣品可以用10 mm光程長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于高濃度的樣品，只需將比色皿旋轉(zhuǎn)90°，使用稍短的2 mm光徑進(jìn)行檢測(cè)。

在使用前一定要仔細(xì)檢查比色皿，如果有刮花或油污，或者上面有指紋，都會(huì)導(dǎo)致不準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。目前市場(chǎng)上的有些分光光度計(jì)很靈活，可以容納多種比色皿，包括微量比色皿。這些微量比色皿使用微量的高濃度樣品，特別適合生物分子（如核酸和蛋白）的測(cè)定。有些分光光度計(jì)是直接把樣品放在測(cè)量窗口上，也十分方便。

軟件要求

沒(méi)人想把時(shí)間花在儀器培訓(xùn)上。因此，在您選擇分光光度計(jì)時(shí)，簡(jiǎn)單易用也是個(gè)重要的考量因素。即拆即用，這當(dāng)然是美了。數(shù)據(jù)管理和存儲(chǔ)也應(yīng)當(dāng)考慮。在有些情況下，電源中斷或系統(tǒng)故障會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)損失。如今有些儀器能直接連到電腦，而不需要額外的軟件或存儲(chǔ)設(shè)備。

隨著技術(shù)的發(fā)展，專(zhuān)為生物學(xué)應(yīng)用而開(kāi)發(fā)的分光光度計(jì)在不斷涌現(xiàn)。相信我們的選擇會(huì)越來(lái)越多，而儀器使用也會(huì)越來(lái)越簡(jiǎn)單、方便、靈活。

返回列表