動(dòng)物組織6-磷酸葡萄糖（G6P）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

貨號(hào)：BC5960

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前將試劑一A全部溶于試劑一B，充分溶解后使用，未用完的試劑2-8℃保存4周（試劑顏色由透明至淡黃色為正?，F(xiàn)象，可正常使用），禁止放-20℃保存。

2、 試劑二：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3、 試劑三：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融（該試劑為凍干試劑，可能存在肉眼觀察不同瓶?jī)?nèi)試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用，實(shí)際質(zhì)量相同）。

4、 試劑三工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑三：蒸餾水=10μL：40μL（共50μL，約4T）的比例配制后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.645mL蒸餾水充分溶解成20μmol/mL 6-磷酸葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，2-8℃保存4周。

6、 0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取25μL 20μmol/mL 6-磷酸葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加975μL蒸餾水充分溶解成0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)配現(xiàn)用。

7、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二：試劑三工作液=1.45mL：25μL：25μL（共1.5mL，約2T）配成工作液后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

6-磷酸葡萄糖（Glucose-6- Phosphate，G6P），又稱(chēng)葡萄糖-6-磷酸，是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)植物體和微生物中。在糖酵解的第一步反應(yīng)中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通過(guò)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸，以繼續(xù)糖酵解的其它步驟；而在戊糖磷酸途徑中，葡萄糖-6-磷酸是其第一個(gè)底物，該過(guò)程也是生成NADPH的主要途徑。此外，葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被儲(chǔ)存起來(lái)。

6-磷酸葡萄糖脫氫酶可催化G-6-P和NADP⁺生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，在340nm處有吸收峰，據(jù)此可以計(jì)算6-磷酸葡萄糖的含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、1mL石英比色皿、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL提取液）加入取液，冰浴勻漿后于沸水浴煮5min（用封口膜封口，防止爆蓋），冷卻至室溫后于4℃ 12000g離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，用蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液37℃預(yù)熱5min。

3、 樣本測(cè)定（在1mL石英比色皿中加入下列試劑）

三、6-磷酸葡萄糖含量計(jì)算公式

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

G6P含量（μmol/g prot）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷（Cpr×V提取）×F

=0.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

G6P含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷W×F

=0.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度，0.5μmol/mL；V提?。杭尤胩崛∫旱捏w積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2. 若樣本ΔA測(cè)定<0.01，可適當(dāng)增大樣本量后測(cè)定；若樣本ΔA測(cè)定>1.2或A測(cè)定>1.5，可用蒸餾水稀釋上清液后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.102g大鼠肝臟加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用1mL石英比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白）=（0.285-0.175）-（0.005-0.005）=0.110，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=（A2標(biāo)準(zhǔn)-A1標(biāo)準(zhǔn)）-（A2空白-A1空白）=（0.492-0.023）-（0.005-0.005）=0.469，按樣本質(zhì)量計(jì)算6-磷酸葡萄糖含量得：

G6P含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =1.150 μmol/g質(zhì)量。

2、 取0.103g大鼠肺加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用1mL石英比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白）=（0.199-0.127）-（0.005-0.005）=0.072，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=（A2標(biāo)準(zhǔn)-A1標(biāo)準(zhǔn)）-（A2空白-A1空白）=（0.492-0.023）-（0.005-0.005）=0.469，按樣本質(zhì)量計(jì)算6-磷酸葡萄糖含量得：

G6P含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.745 μmol/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Belford J, Feinleib M R .The increase in glucose-6-phosphate content of the heart after the administration of inotropic catecholamines, calcium, and aminophylline[J].Biochemical Pharmacology, 1962, 11(11):987-994.

[2] Ashcroft S , Capito K , Hedeskov C .Time course studies of glucose-induced changes in glucose-6-phosphate and fructose-1, 6-diphosphate content of mouse and rat pancreatic islets[J].Diabetologia, 1973, 9(4):299-302.

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