山*醇脫氫酶（SDH）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。
貨號(hào)：BC2535
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：取3.4 mL試劑五加入1瓶試劑一粉劑中溶解，再加入一支試劑四，現(xiàn)用現(xiàn)配，24 h變質(zhì)；

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.4 mL蒸餾水，即10 μmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)品。-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：
SDH（EC 1.1.1.14）催化山*醇脫氫生成果糖，是調(diào)控生物體內(nèi)山*醇含量的關(guān)健酶之一。SDH催化山*醇脫氫生成果糖，同時(shí)還原NAD⁺生成NADH，生成的NADH能將電子傳遞給NBT生成紫色的甲臜，根據(jù)這一原理可以計(jì)算SDH活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲破碎儀，可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000×g 4℃離心10 min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1 g組織，加入1 mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000 ×g 4℃離心10 min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣本：直接檢測(cè)。
二、測(cè)定步驟
1、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570 nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。
2、標(biāo)準(zhǔn)管的測(cè)定：將10 μmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)品用水稀釋至1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液
(1) 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
（2）標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定表

3、樣本的測(cè)定：

將上述試劑按順序加微量玻璃比色皿/96孔板中，加試劑一的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄 10 秒時(shí)的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3分鐘；迅速取出比色皿并擦干，570 nm下比色，記錄3分10秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA測(cè)定=A2-A1。（整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要避光）

注意事項(xiàng)：
1.ΔA大于0.7時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后測(cè)量，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2.測(cè)定過(guò)程中樣本和工作液在冰上放置，以免變性和失活。
3.比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
參考文獻(xiàn)：
Aguayo M F, Ampuero D, Mandujano P, et al. Sorbitol dehydrogenase is a cytosolic protein required for sorbitol metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. Plant science, 2013, 205: 63-75.
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