北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC0455-100T/96S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1035
010-50973130
產品分類
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貨號：BC0455
規(guī)格：100T/96S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體7.5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑六 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑七 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入6 mL蒸餾水，充分混勻。2-8℃可以保存4周。
2、 試劑四：臨用前取1支加入0.6 mL蒸餾水，充分混勻。分裝后-20℃保存，避免反復凍融，可以保存2周；
3、 試劑五：粉劑置于瓶內玻璃管中。臨用前加入10 mL蒸餾水，充分混勻。-20℃分裝保存，避免反復凍融，可以保存4周；
4、 試劑六：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水，充分混勻（可做100T，為保證試劑盒使用時間，故多給一支）；可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑六：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑六，現用現配；
5、 試劑七：臨用前取1支加入0.7 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑七：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑七，現用現配。
產品說明：
蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，屬于糖基水解酶13家族，是一種催化轉移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖。該酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖為供體，多類物質如多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成各種糖苷。
SP能夠催化蔗糖產生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH，導致340nm光吸收值增加。通過340nm吸光度的增加速率來反映SP活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、可調式移液器、研缽/勻漿器、微量石英比色皿/96孔UV板、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5-10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min ，取上清置于冰上待測。
2、細胞或細菌：先收集細胞或細菌到離心管內，離心后棄上清；按照細胞或細菌數量（104個）：提取液體積（mL）為500-1000︰1的比例（建議500萬個細胞或細菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后10000 g，4℃，離心10 min ，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。若液體渾濁可離心后取上清測定。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至340 nm，分光光度計蒸餾水調零。
2、 試劑一37℃預熱10min。
3、 操作表：
空白管 | 測定管 | |
試劑一 | 85 | 65 |
試劑二 | 50 | 50 |
試劑三 | 5 | 5 |
試劑四 | 10 | 10 |
試劑五 | 10 | 10 |
試劑六 | 20 | 20 |
試劑七 | 20 | 20 |
混勻，37℃水浴預熱5min | ||
樣本（μL） | - | 20 |
迅速吹打混勻，記錄測定管第15s的吸光值A1測定（A1空白），迅速置于37℃水浴或培養(yǎng)箱2min（酶標儀有控溫功能可將溫度調至37℃），拿出迅速擦干測定2min15s時的吸光值A2測定（A2空白），計算ΔA =（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）。 空白管只需測定1-2次，如果樣本數量過多也可以將試劑一到試劑七按上述比例混勻后進行測定。 | ||
二、SP活性計算：
1、 用微量石英比色皿測定的計算公式：
(1) 按照蛋白濃度計算
酶活定義：37℃，每毫克蛋白質每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×109÷（V樣×Cpr）÷T = 803.85×ΔA÷Cpr
(2) 按照樣本質量計算
酶活定義：37℃，每克樣本每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×109÷(V樣÷V樣總×W)÷T= 803.85×ΔA÷W
(3) 按照細胞數量計算
酶活定義：37℃，每104個細胞每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/104 cell）= ΔA÷ε÷d×V反總×10 9÷(V樣÷V樣總×細胞數量（萬個）)÷T
= 803.85×ΔA÷細胞數量（萬個）
ε：NADPH摩爾消光系數，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.0002L；V樣：反應體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL ；W：樣本質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，2min；109：1mol=109nmol。
2、 用96孔板測定的計算公式：
將上述公式中的d-1cm修改為d-0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。
注意事項：
1、如果測定吸光值A＞1，建議用提取液稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進行測定。
實驗實例：
1、 稱取0.1 g土豆，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用微量石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=（0.4070-0.3117）-（0.0956-0.0949）=0.0946。計算活性：
蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10 9÷(V樣÷V樣總×W)÷T =760.44 U/ g質量
2、 稱取0.1 g黑米，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用微量石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA =（0.4559-0.3546）-（0.0956-0.0949）=0.1006，計算活性：
蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10 9÷(V樣÷V樣總×W)÷T =808.67 U/ g質量
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