線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ/琥珀酸-輔酶Q還原酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào)：BC3235
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮易揮發(fā)，使用完畢后注意封口，-20℃可保存2個(gè)月；

2. 試劑二工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑二：丙 酮=10μL:1mL（約100T）混合備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3. 試劑三：臨用前取1支加入1mL丙 酮，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝可保存4周（1瓶粉劑溶解后可做100T，為延長(zhǎng)試劑盒使用時(shí)間，此產(chǎn)品多給1支粉劑），注意封口；

4. 工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量將丙 酮：試劑二工作液：試劑三=0.25mL：0.5mL：0.25mL（1mL，約50T）混合備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：
線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基FAD還原為FADH₂，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路。
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通過(guò)檢測(cè)2,6-二氯吲哚酚的減少速率來(lái)計(jì)算該酶活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、細(xì)胞超聲破碎儀、丙 酮、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值大于1.2（微量比色皿）/0.8（96孔板），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.6（微量比色皿）/0.4（96孔板），需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過(guò)增加加入的樣本體積來(lái)提高靈敏度。

2. 樣本蛋白濃度需自行測(cè)定。由于提取液一中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去重懸試劑（提取液一+提取液二）本身的蛋白含量（約0.5mg/mL）。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

4. 附：使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為50T/24S） 

A、上清中復(fù)合體Ⅱ活性的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/g 質(zhì)量）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (W÷V提取×V樣) ÷ T =190.5×ΔA1÷W
B、沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性的計(jì)算:
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/g 質(zhì)量）= [ΔA2×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (W÷V重懸×V樣) ÷ T=76.2×ΔA2÷W
C、樣本復(fù)合體Ⅱ總活性的計(jì)算：
樣本復(fù)合體Ⅱ總活性即為上清中復(fù)合體Ⅱ活性與沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性之和。
復(fù)合體Ⅱ總活性（U/g 質(zhì)量）=190.5×ΔA1÷W +76.2×ΔA2÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。簶颖緞驖{加入提取液一的體積，1mL；V重懸：沉淀重懸加入提取液一和提取液二的總體積，0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；W：樣本重量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
D、以96孔板計(jì)算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。

1. 附：使用細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為50T/24S） 

A、上清中復(fù)合體Ⅱ活性的計(jì)算：
單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (N÷V提取×V樣) ÷ T =190.5×ΔA1÷N
B、沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性的計(jì)算:
單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (N÷V重懸×V樣) ÷ T=76.2×ΔA2÷N
C、樣本復(fù)合體Ⅱ總活性的計(jì)算：
樣本復(fù)合體Ⅱ總活性即為上清中復(fù)合體Ⅱ活性與沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性之和。
復(fù)合體Ⅱ總活性（U/10⁶ cell）=190.5×ΔA1÷N +76.2×ΔA2÷N
ΔA1：上清測(cè)定值；ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。簶颖緞驖{加入提取液一的體積，1mL；V重懸：沉淀重懸加入提取液一和提取液二的總體積，0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶ 計(jì)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
D、以96孔板計(jì)算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Qiuli OuYang, Nengguo Tao, Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. February 2018;(IF4.259)

2. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

3. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury- induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

參考文獻(xiàn)：

1. Mühling J, Tiefenbach M, López-Barneo J, et al. Mitochondrial complex II participates in normoxic and hypoxic regulation of α-keto acids in the murine heart[J]. Journal of molecular and cellular cardiology, 2010, 49(6): 950-961.

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