一氧化氮合成酶分型（TNOS、iNOS、cNOS）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5690

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；

2. 試劑二：試劑放于瓶內(nèi)玻璃瓶內(nèi)，臨用前取1瓶試劑二加入6mL緩沖液，-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑三工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑三：緩沖液=8μL：792μL（0.8mL，10T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 試劑四：臨用前取1支試劑四加入0.6mL緩沖液，-20℃分裝可保存4周，避免反復(fù)凍融；

5. 試劑五：臨用前取1支試劑五加入1.2mL緩沖液，-20℃分裝可保存4周，避免反復(fù)凍融；

6. 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三工作液：試劑四=0.8mL：2.0mL：0.8mL：0.2mL（3.8mL，10T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

7. 試劑八工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑八：緩沖液=10μL：450μL（0.46mL，約11T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；

8. 顯色液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照顯色液A液：顯色液B液=1:1充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

9. 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL亞*酸鈉。臨用前取5μL 10μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，加入995μL蒸餾水，配制成0.05μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

注：試劑二、試劑四、試劑五為凍干試劑，可能存在肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用，實(shí)際質(zhì)量相同。

產(chǎn)品說明：

一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase，NOS，EC 1.14.13.39，此試劑盒后寫為總NOS（TNOS））是生物體內(nèi)催化L-精*酸合成NO的一類酶，主要存在于血管平滑肌、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞等各種細(xì)胞中。根據(jù)其酶活性對鈣離子的依賴性不同，分為結(jié)構(gòu)型NOS（constitutive NOS，cNOS）和損傷誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS，iNOS），前者需要一定濃度的鈣離子方可激活，后者不依賴于外源鈣離子。

NOS催化L-精*酸、分子氧和NADPH，生成NO和NADP⁺，NO在水溶液中極易氧化生成NO₂^-和NO₃^-。在酸性條件下，NO₂^-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算得到NOS活性大小。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機(jī)、分析天平、恒溫水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：建議稱取0.2g樣本，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二，冰浴勻漿后，于4℃，12000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：建議1000萬細(xì)菌/細(xì)胞加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二，冰浴超聲破碎（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間5min），然后于4℃，12000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

3. 液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

注：可根據(jù)樣本量將提取液一和提取液二按照0.98mL：0.02mL的比例混勻后進(jìn)行樣本前處理。

二、 測定步驟

1．可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm，蒸餾水調(diào)零。

2．在2mL EP管按下表順序加樣：

三、NOS活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/mg prot） =（ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

（2）iNOS活性（U/mg prot） =（ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

（3）cNOS活性（U/mg prot）=總NOS活性- iNOS活性

2. 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/g 質(zhì)量）=（ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

（2）iNOS活性（U/g 質(zhì)量） =（ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

（3）cNOS活性（U/g 質(zhì)量）=總NOS活性- iNOS活性

3. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)目計算

單位的定義：每10⁶個細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/10⁶ cell）=（ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（N×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

（2）iNOS活性（U/10⁶ cell） =（ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（N×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

（3）cNOS活性（U/10⁶ cell）=總NOS活性- iNOS活性

4. 按液體體積計算

單位的定義：每mL液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/mL）=（ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷V樣×10³÷T×F=0.83×ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

（2）iNOS活性（U/mL）=（ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷V樣×10³÷T×F=0.83×ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

（3）cNOS活性（U/mL）=總NOS活性- iNOS活性

C標(biāo)準(zhǔn)：0.05μmol/mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.24mL；V樣總：加入的提取液一和提取液二的總體積，1mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)目，以10⁶計；10³：單位換算系

數(shù)，1μmol=10³nmol；T：反應(yīng)時間，60min；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. NOS穩(wěn)定性差，易變性失活，建議使用新鮮樣本實(shí)驗(yàn)，如果不立即實(shí)驗(yàn)，樣本需-20℃保存。

2. 試劑二配制好后，建議根據(jù)樣本量取出所需試劑二，剩余試劑二需盡快置于-20℃保存。

3. 如果?A測定小于0.005或測定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量或者延長第一步37℃反應(yīng)時間后再進(jìn)行測定；如果?A測定大于0.4，建議將樣本勻漿后的上清液用緩沖液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.2047g新鮮小鼠肝臟樣本，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定1=A測定1-A空白=0.088-0.000=0.088，ΔA測定2=A測定2-A空白=0.045-0.000=0.045，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.380-0.000=0.380，按樣本質(zhì)量計算得：

TNOS活性（U/g 質(zhì)量）=0.83×ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.939 U/g 質(zhì)量

iNOS活性（U/g 質(zhì)量）=0.83×ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.480 U/g 質(zhì)量

cNOS活性（U/g 質(zhì)量）=總NOS活性- iNOS活性= 0.459 U/g 質(zhì)量

2. 取240μL馬血清樣本，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定1=A測定1-A空白=0.036-0.000 =0.036，ΔA測定2=A測定2-A空白=0.021-0.000 =0.021，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.380-0.000=0.380，按液體體積計算得：

TNOS活性（U/mL）=0.83×ΔA測定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn) = 0.079 U/mL。

iNOS活性（U/mL）=0.83×ΔA測定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn) = 0.046 U/mL。

cNOS活性（U/mL）=總NOS活性- iNOS活性 = 0.033 U/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] List BM, Kl?sch B, V?lker C. et al. Characterization of bovine endothelial nitric oxide synthase as a homodimer with down-regulated uncoupled NADPH oxidase activity: tetrahydrobiopterin binding kinetics and role of haem in dimerization[J]. Biochemical Journal, 1997, 323(1): 159-165.

[2] Dawson J, Knowles RG. A microtiter-plate assay of nitric oxide synthase activity[J]. Molecular Biotechnology, 1999, 12(3): 275-279.

[3] F?rstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function[J]. European Heart Journal, 2012, 33(7): 829-837.

[4] Kazakov A, Hall R, Jagoda P. et al. Inhibition of endothelial nitric oxide synthase induces and enhances myocardial fibrosis [J]. Cardiovascular Research, 2013, 100(2):211-221.

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