抗氟離子酸性磷酸酶（FRAP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5455

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入1mL蒸餾水，充分溶解，未用完的試劑-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。一支試劑溶解后可以做100T，為了延長(zhǎng)試劑盒使用時(shí)間，因此多給一支粉劑。

2、 試劑四：臨用前加入5.5mL蒸餾水，充分溶解，未用完的試劑2-8℃保存可以保存4周。

3、 試劑五：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑五：蒸餾水=1:9的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取100μL的5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液于EP管中，加入300μL蒸餾水充分溶解，配制成1.25 μmol/mL的酚標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

抗氟離子酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase, FRAP)是酸性磷酸酶的一種。抗氟離子酸性磷酸酶主要分布于在絕大多數(shù)細(xì)胞的溶酶體中、前列腺(prostate gland)、腦、肝臟、脾臟和血小板。

抗氟離子酸性磷酸酶的活性不被氟離子抑制，而其他的酸性磷酸酶的活性則會(huì)受到氟離子的抑制。酸性條件下，抗氟離子酸性磷酸酶催化PN PP生成對(duì)硝 基苯*。對(duì)硝 基苯*在堿性條件下呈黃色，可以在400nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。產(chǎn)物黃色越深，說(shuō)明抗氟離子酸性磷酸酶活性越高，反之則酶活性越低。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、液體：直接測(cè)定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測(cè)定)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、操作表：

混勻后，測(cè)定在400nm處的吸光度，記作A_測(cè)定，A_對(duì)照，A_{標(biāo)準(zhǔn)}，A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。（標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。）

三、FRAP活性計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個(gè)酶活力單位。

FRAP活性（U/mg prot）=(?A_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個(gè)酶活力單位。

FRAP活性（U/g 質(zhì)量）= (?A_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)目計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個(gè)酶活力單位。

FRAP活性（U/10⁴ cell）= (?A_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（N÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

(4) 按血清（漿）等液體體積計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個(gè)酶活力單位。

FRAP活性（U/mL）= (?A_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷V_樣÷T×10³×F=41.67×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}：酚標(biāo)準(zhǔn)液，1.25 μmol/mL ；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.01mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol/mL=10³nmol/mL；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬(wàn)計(jì)；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、 如果測(cè)定的吸光值或?A_測(cè)定大于1.5，可以對(duì)樣本進(jìn)行稀釋或者縮短37℃酶促反應(yīng)時(shí)間；測(cè)定的吸光值或?A_測(cè)定小于0.01，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)37℃酶促反應(yīng)時(shí)間。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1074g兔子肝臟組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，將上清液稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.485-0.067=0.418，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.720-0.070=0.650，帶入公式計(jì)算：

FRAP活性（U/g 質(zhì)量）=41.67×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =499.013 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1057g竹子葉，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.396-0.110=0.286，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.720-0.070=0.650，帶入公式計(jì)算：

FRAP活性（U/g 質(zhì)量）= 41.67×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =173.461U/g 質(zhì)量

3、 吸取0.01mL羊血清，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.126-0.070=0.056，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.720-0.070=0.650，帶入公式計(jì)算： 

FRAP活性（U/mL）=41.67×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F =3.590 U/mL 

參考文獻(xiàn)：

[1] Megat R, Wahab A, Dasor M M, et al. Crevicular tartrate resistant acid phosphatase activity and rate of tooth movement under different continuous force applications[J]. African journ al of pharmacy and pharmacology, 2011, 5(20):2213-2219. 

[2] Natasˇa Mitic′, Mohsen Valizadeh, Eleanor W.W. Leung, et al. Human tartrate-resistant acid phosphatase becomes

an effective ATPase upon proteolytic activation [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics 439 (2005) 154–164.

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